WB实验,怎能输在起跑线!

蛋白样品制备是Western Blotting的第一步,更是决定WB成败的关键。许多朋友在做WB实验时都在吐槽总会遇上这样那样的问题:WB检测信号弱、检测不到条带、磷酸化结果不稳定、膜蛋白检测内参不齐、背景深。出问题解决可以,但咱们还是预防为主,严格按要求做好每一步更为上上策

如何最高效提取不同类型的蛋白?如何更好的保存提好的蛋白下面我们一一讲解。

1、单层贴壁细胞总蛋白的提取

1) 倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。

2) 每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS0.01M pH7.27.3)。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

3)按1ml裂解液加10 μl PMSF100 mM),摇匀置于冰上(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合)

4) 每瓶细胞加400 μlPMSF的裂解液,于冰上裂解30 min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5)裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快),然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中(整个操作尽量在冰上进行)

6)于4℃12000 rpm离心5 min(提前开离心机预冷)

7) 将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于-20℃保存。

2、组织中总蛋白的提取

1)将少量组织块置于12 ml匀浆器中球状部位,用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

2)加400 μL单去污剂裂解液裂(含PMSF)于匀浆器中,进行匀浆。然后置于冰上。

3)几分钟后再碾一会儿再置于冰上,要重复碾几次使组织尽量碾碎。

4) 裂解30 min后,即可用移液器将裂解液移至1.5 ml离心管中,然后在4℃12000 rpm离心5 min,取上清分装于0.5 ml离心管中并置于-20℃保存。

3、加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取

由于受药物的影响,一些细胞脱落下来,所以除按1操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取:

1)将培养液倒至15 ml离心管中,于2500 rpm离心5 min

2)弃上清,加入4 ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤,然后2500 rpm离心5 min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。

3)用枪洗干上清后,加100 μL裂解液(含PMSF)冰上裂解30 min,裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。

4)将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃12000 rpm离心5 min,取上清分装于0.5 ml离心管中并置于-20℃保存。

4、胞浆胞核蛋白提取

建议直接选用胞浆胞核蛋白提取试剂盒。

5、线粒体蛋白提取

建议直接选用线粒体蛋白提取试剂盒。

6、磷酸化蛋白提取

在裂解液中加入磷酸酶抑制剂NaFNa3VO4。同时,样本需要尽量新鲜,蛋白提取后24h内进行WB检测。

经验总结

1、在合适的盐浓度下,保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。

2尽量除去核酸多糖脂类等干扰分子。

3提取蛋白质过程中,应在低温环境下进行,以抑制蛋白酶的水解作用(可加入适合的蛋白酶抑制剂)。

4蛋白样品建议分装后冷冻干燥或直接以液体状态-80℃中保存,不要反复冻融。-20℃保存一般几天没问题,但不保证不会出现降解。

5蛋白浓度低时,可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。

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