Western Blot显色方法怎么选?Affinity助你一臂之力

前面我们已经对Western Blot实验中经常遇到的问题进行总结,问题涉及到WB的各个步骤。其中,封闭和一抗的选择余地不大,二抗的作用是信号扩增,是根据一抗的标记形式而定的。对于无标记一抗,可以选择对应一抗来源种属的二抗,或者Protein A。不过,二抗更可靠的选择是除了对应一抗的种属来源,还需要根据你选择的检测方法选择合适的标记。

底物显色是最后一步,也是最有文章可做的一步。显色的标记方式有生物素标记、地高辛标记、各种酶标记等等,酶标的底物又有各种生色底物、化学发光法底物和荧光底物可供选择,显色方法多种多样,下面我们针对常用的几类方法进行总结对比分析,供大家方便在以后实验中根据自己需求进行选择。

酶促反应较生物素安全且反应快速,是WB中的主流显色方法。酶促反应根据不同底物显色方法又包括化学发光和底物显色。化学发光法灵敏度高,可以达到pg级,而底物显色由于直接显色而操作简单且成本低。最为大家所熟悉的底物显色当数HRP(辣根过氧化物酶,Horseradish Peroxidase)和AP(碱性磷酸酶,Alkaline Phosphatase)。

HRP

这是最常见的酶促发光或显色的交联酶,由于HRP比活高、分子量小、特异性强、稳定性好和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。HRP的底物主要包括化学发光底物生色底物两大类,对于底物的选择,主要考虑的是灵敏度、背景和使用的方便性和稳定性。

1 生色底物

生色底物显色主要是利用底物在有HRPH2O2的存在下失去电子而呈现出颜色变化积累这一过程检测WB的结果。生色底物主要包括DAB4-CNCN/DABAECTMB等。表1对这4种生色底物从不同方面进行比较。其中,DAB应该是最熟悉的底物,灵敏度高,特异性好,缺点就是需要现配现用,显色后光照数小时会褪色,不能永久保存,而且有毒。4-CN反差大容易拍照,可与DAB联用。TMB的信噪比高,成分安全,特别合适于灵敏度要求高的WB,但是也要避免由于灵敏度高而引起的高背景,因此可以相应的延长封闭的时间和注意洗涤的次数。AEC各方面性质与DAB相似,但灵敏度要差一点。

1  4种生色底物比较

底物

DAB

4-CN

AEC

TMB

稳定性

一般

需避光

灵敏度

背景

一般

成像难易

不能很好成像

易成像

-

易成像

颜色

褐色

介于蓝色与蓝紫色之间

棕红色

蓝紫色

毒性

有毒

有毒

2 化学发光底物

化学发光底物最常用的是鲁米诺(Luminol),化学发光法由于仅在酶和底物都存在的时候才会发光,不同于生色反应,所以特别适合在同一张膜上对不同的目标蛋白分别进行多次检测。目前最高检测灵敏度已经达到低飞克(Femto)级别,成为安全且灵敏度最高的WB检测方法。

ECL在许多研究人员心目中的几乎成为化学发光法的代名词,也是文章的保证之一。一般含有鲁米诺、H2O2发光增强剂等物质。发光试剂中的鲁米诺被HRPH2O2氧化,产生荧光,这个过程被发光增强剂加强。其中,增强剂在体系中扮演着核心角色,决定着ECL化学发光的发展。化学发光的常见问题主要是抗体浓度过高,所以抗体用量要比规定的稀释倍数放大,确保不会因为HRP过量导致底物过快消耗完而引起结果不稳定。

AP

AP作为一种经典常用的显色交联酶,自有其优点,如AP的底物显然更稳定。AP显色的灵敏度已经可以达到低pg级,但前提是封闭要做得好。常用的AP包括BCIP5--4--3-吲哚-磷酸盐)、NBT(四唑硝基蓝)和INT(硝基四紫唑),以及它们之间的组合使用,如表2

2  四种常用AP显色方法比较

 

BCIP

NBT

BCIP/NBT

BCIP/INT

作用

O2反应形成沉淀

氧化反应

在碱性磷酸酶(AP)的催化下,BCIP会被水解而产生强反应性产物,该产物与NBT发生反应

氧化反应

灵敏度

100pg

100pg

30pg

一般

沉淀颜色

紫色

蓝紫色

蓝紫色

棕红色

用途

AP显色

AP或者葡糖氧化酶

WB原位杂交和免疫组化

AP和免疫组化

这其中,BCIP/NBT是碱性磷酸酶最佳的底物组合之一,其灵敏度最高,显色比较锐利,成像性也比较好,因此最常被用到。

各种显色方法均有其优缺点和适用范围,上面这些介绍让大家对各种产品的优点缺点一览无遗,希望这些内容可以给大家带来帮助,早日成为一个WB高手。当然,还要提醒大家,注意操作时佩戴手套,部分显色试剂有毒性,避免与皮肤直接接触,记得用后及时彻底冲洗。

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6

 

 

 


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