Western Blot是分析特定蛋白表达量的半定量技术，广泛应用于生物化学、分子生物学、免疫遗传学等领域。管家基因可以作为Western Blot实验中蛋白上样量的内部参照，依赖于我们假定它们在每种组织中及病理条件下持续稳定的表达，并且在这些条件下表达量差不多，而且很少受实验条件的影响，常用的管家基因内参有β-Actin、β-Tubulin和GAPDH。近年来，越来越多的研究表明，管家基因在不同物种、同一物种不同组织、同一组织的不同部位表达量是不一致的，而且在某些病理情况及实验条件下也有很大差异，此时如果用这些管家基因作为内参，会给我们的数据采集、分析带来问题。接下来跟着小编一起来看一下这三种内参的多样变化。

    Actin即肌动蛋白，是细胞内一种重要的骨架蛋白，Actin家族包括6种蛋白，不同的Actin之间同源性高达90%。4种肌肉组织特异性Actin，包括（α-skeletal muscle actin、α-cardiac muscle actin、α-aortic smooth muscle actin、γ-enteric smooth muscle actin），另外2种广泛分布于各种组织中，即非肌肉组织Actin，包括β-Actin和γ-non-muscle actin。说到这里小编想和大家强调一下，如果您研究的样本是4种肌肉组织，那么内参不可以选择β-Actin（因其在4种肌肉组织种表达量极少），如果您的β-Actin在这4种肌肉组织中检测出条带，那么其特异性是值得怀疑的。

1.病理条件下β-Actin表达量的变化

    研究表明，在小鼠脊髓损伤和脊髓肌肉萎缩模型中，该部位的β-Actin表达明显下调，而肾癌细胞系中β-Actin上调（Ferguson,et al. 2005.Proteomics），在一些神经退行性病变中，β-Actin表达也发生变化（Bauer,et al. 2009.J Neural Transm）。

图1. 在脊髓肌肉萎缩小鼠模型中，β-Actin表达下调（Eaton, SL et al. (2013). PLOS One）

2.Actin在同一物种不同组织中表达量的变化

    研究人员分析小鼠的肌肉、心脏、骨、头颅、脾脏及脂肪组织中Actin的表达量，发现在这些不同的组织中，表达量差异很大。

图2. 小鼠肌肉、心脏、骨、头颅、脾脏及脂肪组织中Actin的表达量，如图所示，表达量差异较大（Eaton, SL et al. (2013). PLOS One）

3.β-Actin在同种组织的不同部位表达量的变化

在小鼠的坐骨神经组织中，近端比远端组织中β-Actin表达量高。

图3. 在小鼠的坐骨神经组织中，近端组织及远端组织β-Actin的表达量（Eaton, SL et al. (2013). PLOS One）

5.β-Actin的有效线性范围

    理想的内参应该具有宽泛的线性区间以适应不同蛋白表达水平的样本。Eaton等人的研究发现，在脑组织匀浆中，在总蛋白上样量10~30μg之间β-Actin的线性较好，高于30μg时β-Actin的条带信号趋于饱和。这与Dittmer A等人的研究不完全相符，Dittmer A的实验发现β-Actin在MDA-MB-231中上样量达到2μg时信号就趋于饱和，这种差异可能跟两位研究者所用的实验样本有关，也与显影方法的灵敏度有关，荧光显色的灵敏性要远远高于ECL发光法。

图4. 在脑匀浆中，荧光WB探究β-Actin的有效线性浓度范围（Eaton, SL et al. (2013). PLOS One）

图5. 在MDA-MB-231中，ECL发光法研究β-Actin的有效线性浓度范围（Dittmer A.2006.Electrophoresis）

    关于β-Tubulin与GAPDH作为内参的合理性研究中，Samantha Greer等人研究发现，在小鼠成纤维细胞系 NIH3T3中，β-Tubulin与GAPDH的表达量受细胞密度影响，在同等上样量下，β-Tubulin与GAPDH表达量随着细胞密度的增高而上调，而β-Actin表达量不受细胞密度的影响。小编认为这一发现是很有价值的，也希望研究人员可以验证多种不同的细胞系来支持这一结论（Greer,et al. 2010.Journal of Immunological Methods）。

1.病理学情况下的变化

    研究发现在神经损伤时β-Tubulin与GAPDH的表达量均发生变化（ Bangaru et al. 2012.J Mol Neurosci），在小鼠脊髓肌肉萎缩模型中，β-Tubulin表达下调（Eaton, SL et al. 2013. PLOS One），此外，阿尔兹海默症患者的GAPDH表达下调（Gebhardt et al. 2010.Alzheimers Dement）。

2.β-Tubulin与GAPDH线性浓度范围

        脑匀浆组织中β-Tubulin在蛋白上样量到达8μg时失去线性（Eaton, SL et al. 2013. PLOS One），MDA-MB-231中GAPDH在0.94~7.5μg线性良好，而在上样量低于0.94μg后检测不到信号（Dittmer A.2006.Electrophoresis）。

图6. 在MDA-MB-231中，ECL发光法研究GAPDH的有效线性浓度范围（Dittmer A.2006.Electrophoresis）

图7. 在小鼠脑匀浆组织中，β-Tubulin的有效线性浓度范围（Eaton, SL et al. 2013. PLOS One）

        越来越多的研究证实，管家基因在不同物种、同一物种不同组织、甚至是同一组织不同部位以及病理条件下表达量具有很大的差异性，并且在应用的时候还会受到管家基因的有效线性浓度范围的影响。基于以上原因，越来越多的研究人员建议染总蛋白作为内参，因为在上述情况下，总蛋白的表达量不受影响。接下来，和小编一起看一下具体的数据验证。

1.在病理条件下，总蛋白的表达量变化甚微

        在小鼠的脊髓肌肉萎缩模型中，β-Actin及β-Tubulin的表达都明显下调，但是总蛋白的表达量无显著变化。如下图所示：

图8. 在小鼠脊髓肌肉萎缩模型中，总蛋白（红色荧光标记）的表达量无明显变化（Eaton, SL et al. 2013. PLOS One）

2.不同组织中总蛋白表达量较管家基因恒定

        在小鼠的不同组织样本中，总蛋白的表达量变化较Actin稳定。

图9. 在小鼠的肌肉、心脏、肱骨、头骨、脾脏及脂肪组织中，总蛋白的表达量比较稳定（Eaton, SL et al. 2013. PLOS One）

3.在同一组织的不同部位总蛋白表达量一致

         Eaton等人分析了小鼠坐骨神经的近端及远端，发现相较于β-Actin，总蛋白的表达量较一致。

图10. 分析小鼠坐骨神经的近端及远端组织，分析总蛋白（红色荧光标记）的表达量（Eaton, SL et al. 2013. PLOS One）

4.总蛋白的有效线性浓度范围更宽

        Eaton在脑组织匀浆中研究总蛋白、β-Actin及β-Tubulin的有效线性浓度范围，发现总蛋白的线性范围更宽灵敏度更高。Rena Li等人在Hela细胞中也得到相同的结论。

图11. 在小鼠脑匀浆组织中，在1、5、10、20、30、40μg梯度稀释下，总蛋白的线性变化，可见在40μg时总蛋白的信号仍未饱和（Eaton, SL et al. 2013. PLOS One）

图12. Hela细胞裂解液中，10、20、30、40、50μg梯度上样下，总蛋白、β-Actin、β-Tubulin及GAPDH的线性范围（Rena Li,et al. 2013.Life Sci）

综上所述，总蛋白作为更可靠的内部参照，受到越来越多研究人员的青睐，这并不是说管家基因不适合做内参，只是它们的应用有所局限。未来，一定会有越来越多的文献去验证管家基因作为内参的准确及可靠性，我们一起拭目以待吧！

参考文献

Bauer DE, Haroutunian V, McCullumsmith RE, Meador-Woodruff JH. Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia. J Neural Transm. 2009; 116(4):487–491. [PubMed: 19139805].

Ferguson RE, Carroll HP, Harris A, Maher ER, Selby PJ, Banks RE. Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies.Proteomics. 2005; 5(2):566–571. [PubMed: 15627964].

Eaton, S. L., Roche, S. L., Llavero Hurtado, M., Oldknow, K. J.et al., Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PLoS One 2013, 8,e72457. [PubMed: 24023619].

Dittmer, A., Dittmer, J., Beta-actin is not a reliable loading control in Western blot analysis. Electrophoresis 2006, 27, 2844–2845.[PubMed: 16688701].

Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L., Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells. J. Immunol. Methods 2010, 355, 76–79.[PubMed: 20171969 ].

Rena Li, Yong Sheng. An old method facing a new challenge:re-visiting housekeeping proteins as internal reference control for neuroscience research. Life Sci. 2013 April 19; 92(13):747-751 [PubMed: 23454168].

Gebhardt FM, Scott HA, Dodd PR. Housekeepers for accurate transcript expression analysis in Alzheimer's disease autopsy brain tissue. Alzheimers Dement. 2010; 6(6):465–474. [PubMed:21044776].

Bangaru ML, Park F, Hudmon A, McCallum JB, Hogan QH. Quantification of gene expression after painful nerve injury: validation of optimal reference genes. J Mol Neurosci. 2012; 46(3):497–504.[PubMed: 21863315].