前面我们已经对Western Blot实验中经常遇到的问题进行总结，问题涉及到WB的各个步骤。其中，封闭和一抗的选择余地不大，二抗的作用是信号扩增，是根据一抗的标记形式而定的。对于无标记一抗，可以选择对应一抗来源种属的二抗，或者Protein A。不过，二抗更可靠的选择是除了对应一抗的种属来源，还需要根据你选择的检测方法选择合适的标记。

底物显色是最后一步，也是最有文章可做的一步。显色的标记方式有生物素标记、地高辛标记、各种酶标记等等，酶标的底物又有各种生色底物、化学发光法底物和荧光底物可供选择，显色方法多种多样，下面我们针对常用的几类方法进行总结对比分析，供大家方便在以后实验中根据自己需求进行选择。

酶促反应较生物素安全且反应快速，是WB中的主流显色方法。酶促反应根据不同底物显色方法又包括化学发光和底物显色。化学发光法灵敏度高，可以达到pg级，而底物显色由于直接显色而操作简单且成本低。最为大家所熟悉的底物显色当数HRP（辣根过氧化物酶，Horseradish Peroxidase）和AP（碱性磷酸酶，Alkaline Phosphatase）。

HRP

这是最常见的酶促发光或显色的交联酶，由于HRP比活高、分子量小、特异性强、稳定性好和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。HRP的底物主要包括化学发光底物和生色底物两大类，对于底物的选择，主要考虑的是灵敏度、背景和使用的方便性和稳定性。

1生色底物

生色底物显色主要是利用底物在有HRP和H2O2的存在下失去电子而呈现出颜色变化积累这一过程检测WB的结果。生色底物主要包括DAB、4-CN、CN/DAB、AEC和TMB等。表1对这4种生色底物从不同方面进行比较。其中，DAB应该是最熟悉的底物，灵敏度高，特异性好，缺点就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，而且有毒。4-CN反差大容易拍照，可与DAB联用。TMB的信噪比高，成分安全，特别合适于灵敏度要求高的WB，但是也要避免由于灵敏度高而引起的高背景，因此可以相应的延长封闭的时间和注意洗涤的次数。AEC各方面性质与DAB相似，但灵敏度要差一点。

表1  4种生色底物比较

2化学发光底物

化学发光底物最常用的是鲁米诺（Luminol），化学发光法由于仅在酶和底物都存在的时候才会发光，不同于生色反应，所以特别适合在同一张膜上对不同的目标蛋白分别进行多次检测。目前最高检测灵敏度已经达到低飞克（Femto）级别，成为安全且灵敏度最高的WB检测方法。

ECL在许多研究人员心目中的几乎成为化学发光法的代名词，也是文章的保证之一。一般含有鲁米诺、H2O2和发光增强剂等物质。发光试剂中的鲁米诺被HRP和H2O2氧化，产生荧光，这个过程被发光增强剂加强。其中，增强剂在体系中扮演着核心角色，决定着ECL化学发光的发展。化学发光的常见问题主要是抗体浓度过高，所以抗体用量要比规定的稀释倍数放大，确保不会因为HRP过量导致底物过快消耗完而引起结果不稳定。

AP

AP作为一种经典常用的显色交联酶，自有其优点，如AP的底物显然更稳定。AP显色的灵敏度已经可以达到低pg级，但前提是封闭要做得好。常用的AP包括BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐）、NBT（四唑硝基蓝）和INT（硝基四紫唑），以及它们之间的组合使用，如表2。

表2  四种常用AP显色方法比较

这其中，BCIP/NBT是碱性磷酸酶最佳的底物组合之一，其灵敏度最高，显色比较锐利，成像性也比较好，因此最常被用到。

各种显色方法均有其优缺点和适用范围，上面这些介绍让大家对各种产品的优点缺点一览无遗，希望这些内容可以给大家带来帮助，早日成为一个WB高手。当然，还要提醒大家，注意操作时佩戴手套，部分显色试剂有毒性，避免与皮肤直接接触，记得用后及时彻底冲洗。

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